1)硝酸纖維素膜或尼龍膜上的組織印跡
1.在塑料板上放置兩層Whatman 1號濾紙,在濾紙上方放上一張普通紙,然后鋪上一層尼龍膜。
2.用雙面刀片從植物組織如大豆的莖上切取一塊切片(厚度約為1mm)。如果組織表面是濕的,則在Kimwipes紙上輕輕吸干或先用蒸餾水洗滌幾秒鐘然后再用Kimwipes紙吸干。用鑷子將組織切片轉移到硝酸纖維素膜上,注意一旦將切片放置在膜上就不得再移動切片。在切片上放置4層Kimwipes紙,用手指輕壓15~20秒,用鑷子小心拿開紙和組織切片。組織切片經甲苯酸藍染色后觀察其解剖結果。
3.80℃真空烘烤留有組織印跡的尼龍膜2小時或用UV cross-linker在紫外光下照射尼龍膜。
4.將留有印跡的膜面向下,放入載玻片上的一滴甲苯酸藍溶液中,對組織切片進行染色。2~3分鐘后,吸干多余的染料,用間接照明立刻照相。將載玻片翻轉,透過玻璃拍攝被染色的組織切片。在切片上粘上幾張紙片以免組織切片接觸顯微鏡。
2)用35S-標記的RNA探針檢測植物印跡中的mRNA
1.在Seal-A-MealTM塑料帶中倒入30~40ml洗滌溶液I,65℃清洗留有印跡的尼龍膜4小時。
2.將膜放入20ml雜交溶液中,68℃預雜交4小時。
3.將膜和用35S-標記的RNA放入10ml雜交溶液中,68℃雜交20小時。
4.在 100ml洗滌溶液Ⅱ中42℃清洗尼龍膜20分鐘,換上新鮮洗滌溶液,重復清洗2次。
5.用100ml洗滌溶液Ⅲ在適當的溫度下(60~68℃)。用手提式微型檢測器監控尼龍膜上剩余的放射性。清洗完畢后,有義RNA探針雜交的膜不再有放射性信號,但用反義RNA探針雜交的尼龍膜一般具有可檢測的放射性信號。該信號的強度依賴于目的RNA的豐度。室溫下用0.2×SSC對尼龍膜進行簡單清洗,在空氣中晾干。
洗滌緩沖液Ⅲ:
0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)
1 mmol/L EDTA
6.將膜暴露在X-射線膠卷或Kodak T-max 400膠卷下進行放射自顯影。用水平力如一小疊書使膜和膠卷保持良好的接觸。一般來說,利用T-max 400膠卷比X-射線膠卷具有更高的分辨率。放射自顯影的時間依賴于放射性信號的強弱,通常從4小時到4天。
7.在X-射線處理器中對X-射線膠卷顯影。把T-max400膠卷浸入Kodak T-max顯影液I中顯影1分鐘,將底片轉移到顯影終止盤中30秒后浸入Kodak快速定影液中5分鐘,然后用蒸餾水洗滌5分鐘。
8.在解剖顯微鏡下觀察組織印跡中mRNA的位置。用Kodak Technical Pan Film 2415膠卷拍攝mRNA的定位模式,然后和用苯甲酸藍染色的組織切片解剖結果比較。
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