走進DNA拓撲異構酶I
DNA拓撲異構酶為催化DNA拓撲學異構體相互轉變的酶之總稱。催化DNA鏈斷開和結合的偶聯反應,為了分析體外反應機制,用環狀DNA為底物。
在閉環狀雙鏈DNA的拓撲學轉變中,要暫時的將DNA的一個鏈或兩個鏈切斷,根據異構體化的方式而分為二個型。
切斷一個鏈而改變拓撲結構的稱為Ⅰ型拓撲異構酶(top- oisomeraseⅠ),通過切斷二個鏈來進行的稱為Ⅱ型拓撲異構酶(topoisomeraseⅡ)。
屬于Ⅰ型的拓撲異構酶,有大腸桿菌的ω蛋白(ω-protein,由分子量11萬的單個多肽鏈所成)及各種真核細胞中存在的切斷-結合酶(nicking-closing enzyme,分子量約6萬5千—7萬的及分子量約10萬的)。
Ⅱ型拓撲異構酶,有存在于細菌中的DNA促旋酶、噬菌體T4的拓撲異構酶Ⅱ以及真核細胞中依賴ATP的拓撲異構酶Ⅱ等。
另外,噬菌體λ的irt基因產物和噬菌體φX174的基因A的產物等也具有切斷—結合酶的活性,可認為是拓撲異構酶之一種。
Ⅰ型拓撲異構酶不需要ATP的能量而催化異構體化,作為反應的中間產物,在原核生物來說是游離型的5′-OH末端扣3′-末端與酶形成共價鍵,而真核生物是3′-OH末端5′-末端與酶形成共價鍵。
此酯鍵中所貯存的能量,可能在切斷端的再結合上起著作用。Ⅰ型拓撲異構化酶催化的反應有下列各種:使超螺旋DNA在每一切斷—結合反應中,使L數(參見DNA拓撲學異構體)發生一種變化,即松弛(relaxation)。
將互補的單鏈環狀DNA轉變成具有螺旋結構的雙鏈環狀DNA,使單鏈DNA打結(topological knot)或解結。
另外在二個環狀雙鏈DNA一個分子的一個鏈切斷時,形成鏈環狀二聚體的分子(ca-tenane)。
走進DNA拓撲異構酶I
在Ⅱ型拓撲異構酶中,DNA促旋酶可單獨催化閉環狀DNA產生超螺旋,這是*的。其它二個型的酶,除可使超螺旋松弛也需要ATP的能量外,還可催化促旋酶的催化反應。
真核細胞的拓撲異構酶Ⅰ,參與核小體的形成,細菌的ω蛋白參與轉錄和某種轉位子的插入。促旋酶和T4拓撲異構酶Ⅱ參與DNA的復制和轉錄過程。
DNA拓撲異構酶在DNA解鏈時在將要打結或已打結處作切口。下游的DNA穿越切口并作一定程度的旋轉,把結打開或解松,然后旋轉復位連結。
這樣解鏈就不因打結的阻絆而繼續下去。即使出現打結現象,雙鏈的局部打開,也會導致DNA超螺旋的其他部分過度擰轉,形成正超螺旋。
拓撲酶通過切斷、旋轉和再連接的作用,實現DNA超螺旋的轉型,即把正超螺旋變成負超螺旋。
I (DNA Topoisomerase I)催化4種反應:
1)催化負超螺旋DNA的松弛。
2) 在單鏈環狀DNA分子內形成繩結(Knot t ing) 和解開繩結(Unknotting)。
3)催化具有互補堿基序列的環狀單鏈DNA形成雙鏈閉環狀DNA分子。
4)2個環狀雙鏈DNA分子之中的一個存在DNA鏈的切口時,發生兩個分子的連結反應(Catenation)或者逆反應(Decatenation)。
完整的DNA 拓撲異構酶I(E. coli)全酶是一分子量97 kDa的蛋白。本DNA 拓撲異構酶I是把topA基因(E. coli)在大腸桿菌中進行表達后,經多次純化分離而得到的。
· 質量保證
本DNA 拓撲異構酶I 經多次柱純化,SDS-PAGE膠檢測僅可見清晰單一的目的條帶;PCR方法檢測無大腸桿菌DNA殘留,無核酸內、外切酶污染。
· 使用建議
DNA的結構轉換和解析。
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