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PCR實驗代測再次升級,歡迎來電咨詢
更新時間:2016-04-22   點擊次數:2297次

信帆生物提供 PCR實驗代測,實時熒光定量PCR實驗代測,RT-PCR代測。客戶只需要提供樣本,其他所有試劑都由本公司提供。一般7-10天出結果,提供原始數據,分析數據,實驗報告,實驗室所用儀器型號,圖片,動力擴增曲線等。代測費用現在6.2折*,! 
 
Real -Time PCR,即實時監測PCR擴增產物并進行解析的方法,它是在PCR反應體系中加入熒光物質,并通過Real -Time PCR檢測系統對PCR反應進程中的熒光信號強度進行實時監測,zui終對實驗數據進行分析處理的方法。Real -Time PCR自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來,廣泛應用于生物研究的各個領域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探針法兩種。
 
PCR實驗代測,熒光定量PCR代測服主要儀器及耗材
旋渦振蕩器 :上海青浦瀘西儀器廠產品
手握式電動勻漿機:德國FLUKO 公司產品
低溫冷凍離心機:Sigma(3K15)公司產品
Real-time檢測儀:ABI (ABI-7300)公司產品
超純水分離系統:美國LABCONCO公司
離心管及10μL、200μL、1000μL槍頭等常規耗材均為國產;RNA提取過程中所需的離心管、槍頭等耗材經過0.1%的DEPC水浸泡過一夜,121℃滅菌30min,烘干后備用。
 
PCR實驗代測,熒光定量PCR代測服實驗室試劑的操作
1)所用的所有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
2)所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新鮮蒸餾的去離子水,用0.22μm過濾的,并且是高壓滅菌。
3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑,在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。
4)所用試劑都應該以大體積配制,實驗一下看試劑是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。
5)所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
6)新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。
7)樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。
 

本程序適用于自動PCR操作,可適用于大多數情況,所用酶是不含核酸外切酶活性的熱穩定聚合酶,如Taq聚合酶等。  
引物(各50pmol)  0.2mmol/L dNTPs(必須使用高質量的dNTPs,這一點非常重要。dNTPs經反復化凍后會發生降解,因此應分成小份保存。應注意混合物中四種dNTP的量要相等)  模板DNA:約0.05~1mg基因組DNA或0.002~0.02mg質粒DNA  Taq  DNA聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut)  10×PCR緩沖液(500mmol/L KCl,15mmol /L MgCl 2 ,100mmol/L  Tris ·HCl,pH 8.3)  礦物油  
電泳所需試劑  
【儀器設備】  
PCR擴增儀  
電泳裝置  
微量離心機  
微量移液器(1~20ml和20~200ml)  
0.5ml Eppendorf 管  
紫外線觀察裝置及照相設備 

 操作程序 

1.在無菌的Eppendorf管內加入以下反應物:

2.93℃ 反應2 min后開始以下循環: 
93℃變性反應1 min; 
50℃退火反應1 min; 
72℃延伸反應3 min。 
經過17~35循環后,zui后一個循環72℃增加5 min。循環結束后反應產物置于40℃保存。 
3.取1~5ml反應產物走凝膠電泳,經溴化乙錠染色檢測擴增的情況。
 
 
應注意的問題及其解決方法 

1.PCR反應條件的優化 
要優化特定的PCR反應,有必要試用不同的反應組分和循環參數。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對反應結果的影響,從中大家可以得到一些線索以改進反應條件,提高PCR產量和/或特異性,一般情況下,只須改變一兩個參數就行了,如pH值和MgCl2濃度。表2-2給出了循環參數對PCR結果的影響。 
表2-1 PCR各反應組分濃度對產物特異性和產量的影響

反應組分提高產量提高特異性
模板濃度增加減少
引物濃度高至75 pmol低至15 pmol
引物長度增加
dNTPs各1 mmol/L各20 mmol/L
Tris-HCl (10 mmol/L pH8)pH高至10*pH高至10*
MgCl2高至4 mmol/L1.5 mmol/L
DMSO10%**
甘油2%
甲酰胺5%
Taq DNA聚合酶***高至5U0.5U


* 效果可能不可預測
** 添加10% DMSO時,Taq DNA聚合酶的活性會被抑制47%,因此反應加大Taq DNA聚合酶的用量(即5U)予以補償
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改變以提高PCR產物的特異性和/或產量的循環參數

反應條件提高產量提高特異性
循環數zui多35個減至25個
變性*增至1 min
引物退火**降至45℃升至72℃
引物延伸***在后期循環中延長維持30s


* 使用基因組DNA作模板時,開始幾個循環變性應于97℃進行 
** 假定Tm值為60℃ 
*** 延伸時間依產物大小而定:1000bp的產物延伸30s即可,產物更長時,按每1000 bp延伸0.5 min計,在后期循環中增加延伸時間可以提高擴增效率
2.引物的設計 
毫無疑問,引物的堿基組成,長度及其靶序列的同源性是決定PCR成敗的首要因素,選擇設計引物在一定程度上仍然要靠經驗,對于某一對引物而言尚無通用的規則可嚴,但應遵守以下原則: 
(1)一般性原則: 
①長度:15~30bp,其有效長度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38,否則PCR的zui適延伸溫度會超過Taq酶的作用溫度(74℃),從而降低產物的特異性。 
②G+C含量:應在45%~55%之間,PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5~10度。引物長度小于20時,其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。 
③ 堿基分布的隨機性:應避免連續出現4個以上的單一堿基。尤其是不應在其3’端出現3個的連續的G或C,否則會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。 
④ 引物自身:不能含有自身互補序列,否則會形成發夾樣二級結構。 
⑤引物之間:兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基,不然會形成引物二聚體,尤應避免3’端的互補重疊。 
⑥特異性:與非特異擴增序列的同源性應小于70%,或少于連續8個的互補堿基。 
(2)引物的3’端: 
引物的3’端很大程度上影響Taq酶的延伸效應,除特殊情況(AS-PCR)外,3’端不應發生錯配。S. Kwok等發現,引物的3’端發生錯配時,A:A使產量下降至1/20,A:G或C:C下降至1/100。當末位堿基是T時,即使錯配也能引發鏈的合成,而為A時錯配的引發效率zui低,G、C居間。 
因此,引物的3’端堿基選用A、G、C,而盡可能地避免選用T,尤應避免連續出現2個以上的T。 
此外,如果擴增編碼區域,引物的3’端不要終止于密碼子的第3位,因此處易發生簡并,從而影響擴增特異性。 
(3)避開引物的二級結構區: 
某些引物無效的原因是引物重復區二級結構的影響,因此選擇擴增片段時應注意避開二級結構區,有些計算機軟件可幫助確定該區域,如不能避開,則可用7- deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP,有助于PCR成功。 
目前在引物選擇中已廣泛應用計算機軟件,從EMBL或Genebank中查找有關基因序列,并依據上述原則對所選用引物進行評價。 
3.出現異常結果時的解決思路 
在做PCR反應的過程中,由于其酶促反應的本質,影響zui終結果的因素較多,所以出現一些非預料的結果是可以理解的。下面簡單地總結一下在PCR反應結果出現異常時我們應該采取的措施。 
(1)電泳檢查沒有 PCR產物 
a.需檢查一下Taq DNA聚合酶是否失活,或是活性太低,還需查一下在加樣過程中是否向體系中加過Taq DNA聚合酶; 
b.需檢查一下所使用的引物,看其序列設計是否正確,是否堿基組成不平衡; 
c.需要檢查一下PCR反應過程中模板是否變性充分,尤其在前幾個循環中是否變性充分;可以適當地提高模板變性的溫度或是適當延長變性的時間;  
d.需檢查一下在PCR反應體系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制劑,如SDS污染等等; 
e.需檢查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染,可以預先加熱使之失活。 
(2)電泳檢查出現引物二聚體區帶 
a.需檢查一下兩個引物的3’端是否互補,或者是否有相類似的回文結構; 
b.需檢查一下使用的引物是否太短,可以予以適當的延長; 
c.需檢查模板的用量,模板以10-4個拷貝為,模板太少會造成引物相對過量; 
d.適當地降低引物的濃度,引物濃度過高是出現引物二聚體的zui主要原因;  
e.循環次數太多也易形成引物二聚體,可以適當地減少循環數;  
f.可以將復性溫度提高一些以減少引物二聚體形成。  
(3)電泳檢測PCR產物呈片狀(smear)  
a.需檢查一下Taq DNA聚合酶的用量,適當地減少Taq酶的量有助于特異性條帶擴增;  
b.可以提高反應的退火溫度,或者直接采用兩個溫度的PCR(68℃退火和延伸,94℃模板變性);  
c.適當地降低Mg 2+ 的濃度也可起到降低非特異性擴增可能性的作用;  
d.適當地減少反應退火的時間和延伸的時間;  
e.適當地減少循環次數也會有效果;  
f.可以嘗試使用巢式引物PCR(nested primer PCR)。  
(4)電泳檢測PCR產物出現其它非特異性條帶  
a.需檢查一下引物的3’端是否有連續排列的G或C;  
b.可以適當地提高退火溫度或直接采用兩步溫度PCR方法進行擴增;  
c.可以降低Taq DNA聚合酶的用量,同時也降低引物的濃度;  
d.可以適當地減少退火所用的時間以及延伸反應的時間;  
e.可以適當地增加或減少一些Mg 2+ 濃度。  
4.假陽性  
實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現一個或幾個陽性結果,提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染、擴增試劑污染、擴增產物交叉污染等。常見的污染來源包括實驗室環境、加樣器、操作中形成的噴霧、DNA抽提儀器、試劑及任何與擴增產物接觸的東西。  
預防各種污染的措施主要有:(1)工作區隔離。(2)改進實驗操作,如在加樣過程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。(3)操作程序合理化,如后加陽性對照等。  
交叉污染的處理方法包括:(1)在DNA模板和多聚酶加入前,紫外線照射反應管內容物以破壞污染的PCR產物。一般選用波長254nm照射30min(Nature, 1990, 34:27)。(2)PCR實驗中使用dUTP,而不用dTTP。在擴增前使用UraciⅠN-glycosylase(糖基化酶)處理可降解交叉污染的PCR產物,而不降解基因組DNA模板,然后熱滅活此酶,再進行擴增反應(Gene, 1990, 93: 125)。美國PE公司提供此類試劑盒(PCR carry-over preventionkit)。(3)在PCR反應前加入一種光化學試劑,反應完成后激活該試劑,光化學試劑可交聯 DNA鏈,使之不能再擴增(Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99)。  
2.2.2.5 PCR技術在分子生藥學中的應用  
對于生藥學家來說,PCR技術已稱為他們研究生藥的一種嶄新而有力的工具。PCR技術在生藥學中的應用主要有兩方面:①擴增和直接測序或者對屬性特異的DNA序列定性以用于系統發育或親緣關系的分析,也可用于鑒定品種;②通過簡單純化從復雜生物樣品的混合物中鑒定病原體和土壤微生物,用于藥用植物的基因工程。
 

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