游離脂肪酸(free fattyacid,F(xiàn)FA)含量測定試劑盒說明書 測定意義: FFA既是脂肪水解的產(chǎn)物,又是脂肪合成的底物。FFA的濃度與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌 功 能有關(guān),也可反映食物貯藏中的品質(zhì)變化。 測定原理: 在弱酸性條件下,F(xiàn)FA 與銅鹽反應(yīng)生成銅皂,在 715nm 處有特征吸收峰,在一定范圍內(nèi)游 離脂肪酸含量與顯色程度呈線性關(guān)系。 自備儀器和用品: 研缽、臺式離心機、可見分光光度 計、1mL 玻璃比色皿。 試劑組成和配制: 試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。 試劑二:液體×1 瓶,4℃保存。 試劑三:液體×1 瓶,4℃保存。 樣品中 FFA 提取: 1、 血液:將所取血液,室溫靜置1 h 后,于4 ℃ 離心機 3500 rpm離心 15min,取上清0.1mL, 加 1.2mL 試劑一,震蕩提取 3h,8000rpm,4℃離心 10min,取上清液待測。 2、 組織:組織用蒸餾水沖洗干凈后,用吸水紙吸取表面水分,搗碎后稱取約 0.1g 轉(zhuǎn)移至離 心管,按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:12 的比例加入試劑一,震蕩提取 3h, 8000rpm,4℃離心 10min,取上清液待測。 3、 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(10 4 個):試劑一體積(mL)為 500~1000:1.2 的比例(建 議 500 萬細胞加入 1.2mL 試劑一)加入試劑一,冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超 聲 2 秒,間隔 3 秒,總時間 3min);震蕩提取3h,然后 8000rpm,4℃,離心 10min,取 上清待測。 測定操作: 1. 分光光度計預(yù)熱 30 min 以上,調(diào)節(jié)波長到 715 nm。 2. 對照管:取上清液 1mL,加 0.5mL 試劑二,充分震蕩 5min,室溫靜置 5min,取上層 0.8mL 于 1mL 玻璃比色皿,調(diào)零。 3. 測定管:取上清液 1mL,加 0.5mL 試劑三,充分震蕩 5min,室溫靜置 5min,取上層 0.8mL 于 1mL 玻璃比色皿,測定吸光值,記為 A。 記為 A 測定管。 FFA 含量計算: 標(biāo)準曲線:y=0.0075 x+ 0.0055,R 2 =0.994 1. 血液中 FFA含量計算 FFA(μmol/L)=(A-0.0055)÷0.0075×V 反總÷V 樣=1333×(A-0.0055) 2. 組織中 FFA含量計算 (1)按樣本蛋白濃度計算 FFA(μmol/mg prot)=(A-0.0055)÷0.0075×V 反總÷(V 樣×Cpr)= 0.133×(A-0.0055)÷Cpr (2)按樣本質(zhì)量計算 FFA(μmol/g)= (A-0.0055)÷0.0075×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)= 0.16×(A-0.0055)÷W 3. 按細胞數(shù)量計算 FFA(μmol/10 4 cell)= (A-0.0055)÷0.0075×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量) = 0.16×(A-0.0055)÷細胞數(shù)量 V 樣總:上清液總體積,1.2 mL;V 反總:反應(yīng)總體積,1mL;V 樣:加入樣本體積,1mL; W:樣本鮮重,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL |