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1. 實驗中選擇一抗 

 檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體，需要考慮如下幾種因素：

1.分析試驗應用的類型： 一般抗體說明書都列出該抗體經試驗驗證過適用于何種分析類型，如：可以應用于 WB IHC ICC ELASA 分析等，如果抗體說明書沒有提及的應用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型，而僅是說明尚未經過此種分析試驗驗證，如果抗體不適用某些分析試驗，則會在抗體說明書上標注出來不適于某分析試驗。

 2.樣本蛋白的結構性質： 了解樣本蛋白的結構性質有助于選擇合適的抗體，至少兩方面因素需要考慮：

 （1）待測樣本蛋白的結構域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機體（如：細菌）或細胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用 FACS 流式檢測活細胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。（2）樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經過某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結構阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識別天然折疊狀態的蛋白。當選擇免疫組化的抗體時，應注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復解交聯步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會在抗體說明書上應用部分標示出來。

 3.樣本的物種： 應選擇物種相同或有交叉反應的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過，應通過序列比對的方法來預測交叉反應，可應用 Expasy 和 NCBI BLAST 來進行不同物種蛋白同源性比對。

1. 一抗宿主物種的選擇： 一般說來，在使用偶聯二抗結合無偶聯物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白產生交叉反應，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應選擇小

   鼠或大鼠源的一抗，選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔 IgG。如果選擇有偶聯物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含 IgG 的細胞裂解物樣本的 westernblotting 檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含 IgG，在 western blot 檢測中則結合出現 IgG 分子 50 and 25 kDa 的重鏈和輕鏈條帶。

    

2. 如何選擇二抗 

3. 根據一抗種屬及類型選擇合適的二抗廣義上是指專門和進行特異性反應和結合的抗體，在免疫學反應中，經常需要針對試驗選擇不同的二抗，我們能為您的科研工作提供適合和全面的二抗產品。檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時在后繼試驗中也會有不同的檢測方案，因此在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測方案的要求，一般來說，選擇合適的二抗需要從下面幾個方面考慮：

    

   【一抗的種屬來源】 二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據一抗的物種來源選擇相應的抗該物種的二抗。

    

   【一抗的類別亞型】 二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是 IgG 類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗 IgG 抗體。其中單克隆抗體的類別及亞類通常會在產品說明書中都會有描述，如果你的一抗是小鼠 IgM，那么相應的二抗就應當是抗小鼠 IgM。如果單克隆一抗是小鼠 IgG 的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠 IgG 都可以與之結合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠 IgG1，那么你可以選擇抗 IgG1 的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應物種 IgG。

    

   【二抗的種屬來源】 一般來說，不同的種屬來源與二抗的質量沒有必然的lian系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里，如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。 有相應的驢來源的二抗，非常適合做類似雙標的免疫實驗。

    

   【二抗的耦聯標記】 一般來講，耦聯到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶 HRP 和堿性酶 AP 或其衍生物 APAAP，PAP），熒光基團（FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight 等）、生物素、金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于 Western Blot 和 ELISA，常用的二抗是酶標二抗；而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用 Biotin/Avidin 檢測系統。在一些熒光檢測方案中，則需要選擇不同的熒光標記；而金顆粒標記的二抗則更多的應用于免疫電鏡中。

    

   【是否經過血清吸附過的二抗】如您的檢測樣本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果您對實驗的特異性要求很高，那我們向您推薦經過人血清吸附過的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經過人血清吸附而排除了與人源組織（如 IgG 等）可能發生非特異性反應的 IgG，因此將非特異性結合降低到低。

    

   【Anti-IgG 還是 Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】 在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細胞、淋巴細胞、B 細胞等細胞內，通常含有較多的 Fc 受體，這時候選擇二抗時選擇 Anti-IgG, F（ab’）2 fragment 這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于 Fc 部分與 IgG 的非特異性結合。常規的 Anti-IgG （H+L）二抗與 IgG 的重鏈和輕鏈都有結合反應，即與 IgG 的 Fc 的 F（ab’）2 片段都能結合；

   由于 IgG、IgM、IgA 都有保守的輕鏈結構域，因此 Anti-IgG （H+L）與它們都有交叉反應。而 Anti-IgG, F（ab’）2 fragment 經過了 IgG Fc 片段的吸附，因此只與 IgG 的 F（ab’）2 片段結合，然而 IgG、IgM、IgA 都有保守的輕鏈結構域，因此與它們也有交叉反應。

    

   【Anti-IgG（H+L）、Anti-IgG （gamma）、Anti-IgM （mu）、Anti-IgA （alpha）】 在一些特殊的實驗里，只需要檢測樣本里的 IgG 或者 IgM，常規的 Anti-IgG （H+L）由于與 IgG 的重鏈和輕鏈都有結合反應，而 IgG、IgM、IgA 都有保守的輕鏈結構域，因此不能特異性的檢測某種類型的 IgG 或者 IgM。這時候就需要針對特殊類型 Ig 分子的二抗。Phygene 備有全面的二抗現貨產品并能提供完整的二抗產品線。按照標記分，有 HRP、AP、生物素等標記二抗，FITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight 等熒光二抗；按照檢測物種分，有抗人、大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉鼠、狗、牛，以及多種細菌類二抗；另外，還有 IgG、IgA、IgM以及 IgG（Fc）、IgG（ab’）2 等不同類型抗體。

   如抗原為 A C 物質，產生的抗體為抗-ac， 如抗原為 B C 物質，產生的抗體為抗-bc，

    AC 物質和抗-ac、BC 物質和抗-bc 產生的是特異性結合，而 AC 物質和抗-bc、BC 物質和抗-ac 就會產生交叉反應.