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環酰苷放免試劑盒操作說明書
CAMP RIA KIT
一、藥物供應試驗
1.BSA 1瓶(用于配制0.2%BSA的醋酸緩沖液):溶于 15 毫升50mM PH 4.75
的醋酸緩沖液(配法見后)
2.乙酰化劑試劑:使用前將三乙胺和醋酐混勻即可(三乙胺和醋酐各一瓶)
3.125I- CAMP1瓶:使用時用50 mM醋酸緩沖液 10 毫升稀釋標記品(約2萬CPM左右/0.1ml).
4. CAMP標準1瓶:取 100 微升,用 2.6 毫升50 mM醋酸緩沖液稀釋為2pmol/0.1ml,然后倍比稀釋成8個濃度點:1、0.5、0.25、0.125、0.062、0.031、0.016、0.008pmol/0.1ml
(B1~B8)。
5. CAMP抗血清一瓶:使用時用含0.2%BSA的醋酸緩沖液13 毫升溶解
6.羊抗兔IgG血清1瓶,每瓶用 10 ml生理鹽水溶解即可,4℃保存。
7.正常兔血清1ml,用 10 ml生理鹽水溶解即可4℃保存。
8、EDTA抗凝劑1瓶。
9、醋酸緩沖液1瓶: 1:4稀釋(1份該液加3份蒸餾水)。
二、操 作
CAMP RIA 加液程序 (單位: ul )
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試 劑 T NSB B0 S1~S8 樣 品
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醋醋緩沖液 —— 200 100 —— ——
標 準 品 —— —— —— 100 ——
樣 品 —— —— —— —— 100
乙酰化試劑 —— 5 5 5 5
抗 血 清 —— —— 100 100 100
125I-CAMP 100 100 100 100 100
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充分混勻,4℃ 過夜。
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正常兔血清 100 100 100 100 100
羊抗兔IgG 100 100 100 100 100
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充分混勻,4℃ 過夜。
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搖勻,室溫放置2~3h, 3000rpm離心15分鐘,吸去上清,在γ計數器上測定沉淀CPM數。
三、計算
NSB為非特異結合管,標準曲線及樣本測得值均需減去NSB值,以B/B0計算標準及待測樣品結合百分率,在半對數紙上繪制標準曲線,并查出樣品值。或由γ計數器預先編制得程序,直接給出有關參數、標準曲線及樣品濃度。或從EXEL表格中的直線回歸方法計算。所得結果乘以稀釋倍數即可。
四、樣品收集
1、需配試劑
1) EDTA抗凝劑。取9.3克EDTA二鈉鹽加入1mol/L NaOH溶液25ml,溶解后加水到50ml.。
2) 50mMPH4.75醋酸緩沖液,(含4mM EDTA):取27.22克NaAc . 3H20溶于1000ml蒸餾水,即為0.2M NaAc,用冰醋酸配制0.2M醋酸,然后取410毫升0.2M HAC和590毫升0.2M NaAc混勻,測PH值調到PH 4.75,然后每1000毫升溶液加入5.95克 EDTA 二鈉鹽溶解即可.此溶液為200 Mm pH 4.75 的醋酸緩沖液,EDTA為16mM。使用時將該液1:4稀釋。(1份該液加3份蒸餾水)即成50mM pH4.75醋酸緩沖液,含EDTA 4Mm.
2、血樣本處理
1) 取靜脈血1~2ml,注入含DETA抗凝劑50ul的試管中,搖勻,一小時內離心4℃,2000rpm離心10min,分離血漿, —20℃保存,嚴禁反復凍融。
2) 血漿處理:取0.1ml血漿加入2ml無水乙醇,振搖1分鐘,靜置5分鐘,3000轉/分離心10分鐘。將上清液到入指形管或青mei素小瓶,殘渣再加入75%乙醇1ml,勻漿,3000rpm離心10分鐘。合并上清液,于60℃烤箱中吹干,殘渣放于4℃保存。測量時用1ml醋酸緩沖液溶解,然后取0.1ml測量,此時稀釋倍數為100。結果×100即為pmol/ml.
3、組織樣品處理
取組織50毫克左右放入盛有2ml冷的50mM PH4.75醋酸緩沖液的試管內(冰浴),勻漿,加入2ml無水乙醇,混勻,靜止5分鐘,3500轉離心15分鐘,將上清液收集在青mei素小瓶內,再用75%乙醇2ml洗沉淀,勻漿分散,混勻,3500轉離心15分鐘。合并上清液,60℃烤箱中吹干,殘渣放于4℃保存。測量時用1ml醋酸緩沖液溶解,然后取0.1ml測量。
4、對于血、組織樣本,不同血樣或組織中的CAMP或CGMP含量不同,測試前預實驗確定樣品稀釋度。
五、正常人血漿參考值:
CAMP:23.1±7.7pmol/ml
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